山東出入境檢驗檢疫局　高宏偉  劉心同  陳世山  丁士兵  昃向君　中國計量科學(xué)研究院  施昌彥

　　一、目標(biāo)

　　按ISO21570(Foodstuffs-Detection of genetically modified organisms and derived products-Quantitative nucleic acid based methods)測定大豆樣品中轉(zhuǎn)基因大豆含量定量檢測的不確定度。
　　本課題是對動植物檢驗檢疫領(lǐng)域定量檢測項目進(jìn)行不確定度評定的嘗試。    

　　二、測量程序

　　1.DNA提取
　　大豆DNA的提取，按照國際標(biāo)準(zhǔn)草稿ISO/DIS 21571(Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -Nucleic acid extraction)進(jìn)行。

　　2.定量檢測
　　(1)陽性參照標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)立(可任選其一)。
　　(2)將轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(%)的DNA，調(diào)整至相同濃度(ng/μL)，作為定量反應(yīng)的模板。
　　(3)對含有待檢外源基因和內(nèi)源基因的陽性質(zhì)粒DNA，將其濃度調(diào)整為相同體積含有不同DNA拷貝數(shù)(如:0、10、100、1000、10000拷貝/5μL或0.01、0.1、1、10、100pg/μL的DNA)，作為定量反應(yīng)的模板。
　　(4)實時熒光PCR反應(yīng)體系。
　　實時熒光PCR反應(yīng)體系見表1，引物序列按ISO21570的規(guī)定。
    

　　(5)實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)。
　　實時熒光PCR的反應(yīng)參數(shù)為:50℃/2min；預(yù)變性95℃/3min；95℃/15s，60℃/1min，40個循環(huán)。

　　(6)上機(jī)運行。
　　按預(yù)先設(shè)定的樣品擺放順序，依次擺放PCR反應(yīng)管，在樣品名輸入處編輯實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)并開始運行儀器。運行結(jié)束后分析并保存數(shù)據(jù)。

　　(7)基線的設(shè)置和數(shù)據(jù)記錄。
　　反應(yīng)結(jié)束并分析結(jié)果后，應(yīng)設(shè)置無效基線范圍。無論采用哪條熒光通道(FAM或TET)，基線范圍選擇在3～15個循環(huán)，閾值設(shè)置原則上以基線剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點，且以Ct值等于40為準(zhǔn)。

　　(8)使用質(zhì)粒作為定量檢測參照物的結(jié)果計算。
　?、倮L制標(biāo)準(zhǔn)曲線和推導(dǎo)回歸方程
　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中含有的作物內(nèi)源基因和外源基因的量，以及所得Ct值之間的對應(yīng)關(guān)系，分別以Ct值為縱坐標(biāo)，以內(nèi)源基因或外源基因量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線并可分別得到內(nèi)源基因或外源基因的線性回歸方程。
    
　　式中:A——樣品中內(nèi)源基因或外源基因的量；Ct——樣品的Ct值；k——標(biāo)準(zhǔn)曲線在y軸的截距；m——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
　?、诖郎y樣品中轉(zhuǎn)基因成分含量的計算
　　將所測得的待測樣品外源基因或內(nèi)源基因的Ct值代入各自的回歸方程，計算出樣品中內(nèi)源基因或外源基因的拷貝數(shù)。根據(jù)公式(1)計算樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。
    
    式中:C——樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量，%；A_外——樣品中外源基因的量；A_內(nèi)——樣品中內(nèi)源基因量。    

　　三、檢測結(jié)果(如圖1所示)

    圖1  檢測結(jié)果

　　對1個含轉(zhuǎn)基因大豆的大豆樣品做7次平行測定，結(jié)果見表2。
    

　　四、數(shù)學(xué)模型

　　
　　式中:C——樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量，%；Ct——樣品中外源基因或內(nèi)源基因的Ct值；k——標(biāo)準(zhǔn)品中外源基因或內(nèi)源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線在y軸上的截距；m——標(biāo)準(zhǔn)品中外源基因或內(nèi)源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。    

　　五、不確定度來源(如圖2所示)    

    圖2  樣品測量不確定度來源因果圖

　　六、標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

　　1.A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定
　　A類不確定度由各類隨機(jī)效應(yīng)引起，計算如下:
　　
    

　　2.B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定
　　(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)Ct值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度
　　標(biāo)準(zhǔn)系列樣品的測量值和計算數(shù)據(jù)如表3和表4所示，用最小二乘法計算曲線方程。
    

    在樣品實際檢測中，標(biāo)準(zhǔn)曲線只做1個重復(fù)，在測量點A_外=0.031和A_內(nèi)=0.845處，Ct_外=30.340和Ct_內(nèi)=25.040(平均值)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量計算如下:
    在試樣的測量次數(shù)p=1時，最小二乘法引入的不確定度分量為:
    
    式中:s(1gA)——由標(biāo)準(zhǔn)溶液Ct值殘差計算的標(biāo)準(zhǔn)差；n——標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)；lgA₀——實測點濃度的對數(shù)。
    
    故其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
    
    內(nèi)源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度u(Ct內(nèi))分量為:
    
    故其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
    
    標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度是用統(tǒng)計原理計算得到的，其自由度為n-2。所以:
    

　　(2)移液槍的標(biāo)準(zhǔn)不確定度
    移液槍造成的不確定度呈均勻分布。
    移液槍在其測量范圍(10～100)μL(V₀)內(nèi)的最大允差為±0.1μL，由此帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度(μL)。使用的加樣體積為12.5μL，故其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u_rel1=0.0577/12.5=0.0046。
    移液槍在其測量范圍(0.5～10)μL(V₁)內(nèi)的最大允差為±0.02μL，由此帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u₂=0.02/=0.0115(μL)。使用的加樣體積分別為2μL、2μL、8.2μL，故其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為u_rel2=0.0115/2=0.0057、u_rel3=0.0115/2=0.0057、u_rel4=0.0115/8.2=0.0014。
    移液槍在其測量范圍(0.1～2.5)μL(V₁)內(nèi)的最大允差為±0.002μL，由此帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u₃=0.002/=0.0011(μL)。使用的加樣體積為0.3μL，故其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u_rel5=0.0011/0.3=0.0036。
    考慮到各范圍測量的獨立性，移液槍允差帶來的合成相對不確定度為:
    
    標(biāo)準(zhǔn)不確定度以最大偏差估計，其自由度可取為無窮大，即ν₃=ν₄=ν₅=∞。

　　(3)B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成
    B類不確定度各分量u_rel外，u_rel內(nèi)，u_rel槍相互獨立，所以其靈敏系數(shù)均為1，u_rel外，u_rel內(nèi)，u_rel槍合成為B類合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_ref:
    

　　3.合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定
　　考慮到A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度和B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度相互獨立，則
    
    

　　七、擴(kuò)展不確定度評定和報告

　　U=k×u_c，包含因子k為置信水準(zhǔn)p=95%、自由度ν=6的t分布臨界值，按非整ν內(nèi)插計k=2.45，故U=2.45×0.5201%=1.3%。
　　測量結(jié)果C%=3.73%±1.3%，其中1.27%是擴(kuò)展不確定度U，它取決于合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_c=0.5201%和包含因子k=2.45，k的值基于置信水準(zhǔn)p=95%、自由度ν=6的t分布。

　　致謝:本文得到了國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局課題《食品安全實驗室質(zhì)量管理、技術(shù)運作和評審認(rèn)可體系的研究》(2003IK037)的資助。