衛(wèi)生部臨床檢驗中心　汪靜  郭健  陳文祥  謝潔紅  張傳寶  馬嶸  趙海艦

本文為“第一屆《中國計量》中青年優(yōu)秀科技論文獎”三等獎獲獎文章之一

　　酶學測定是臨床檢驗的常規(guī)項目，其測定結果的不確定度評估目前在國內尚未開始。但國內酶學參考實驗室網(wǎng)絡已略具雛形，其主要功用之一是為酶參考物質賦值，無論是國際還是國內均要求在給出參考物最佳期望值的同時給出該值的不確定度，因此，如何評估酶學參考方法測定結果的不確定度就成為一個亟待解決的問題。我們通過詳細分析在本實驗室條件下運行國際臨床化學聯(lián)合會(IFCC)丙氨酸氨基轉移酶(ALT)參考測定方法的全部過程，參照JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》、JJF1135-2005《化學分析測量不確定度評定》、CNAS-GL06《化學分析中不確定度的評估指南》，對測定結果的不確定度進行試評估，希望能建立一種較為科學合理的酶學參考方法測定結果不確定度的評估模式。    

　　一、材料與方法

　　1.樣品
　　凍干人血清，復溶體積5mL，在-20℃下保存。復溶采用稱重法，記錄兩次稱重數(shù)據(jù)及水溫，查《1990年國際溫標純水密度表》換算出實際復溶體積。

　　2.試劑
　　乳酸脫氫酶(LDH)購自ROCHE公司，其余試劑購自SIGMA公司。按照IFCC 37℃ ALT參考測定方法中的試劑配方進行試劑配制，所用天平為 級(特種準確度級)，pH計為0.1級(示值誤差≤|±0.01|)，容量瓶為A級，溫度計準確度為±0.02℃，所有稱量步驟的擴展不確定度(k=2)均小于1.5%。

　　3.儀器
　　HITACHI U3000可見紫外分光光度計及配套比色皿溫度控制附件，D642高精度溫度計，THERMO 520A pH計，METTLER AE163電子天平，EPPENDORF移液器，HAMILTON稀釋分配器。

　　4.測定方法
　　測定原理為樣品(200μL)中的ALT催化反應試劑(2000μL)中的L-丙氨酸與啟動試劑(200μL)中的α-酮戊二酸，使之轉化為丙酮酸與L-谷氨酸，新生成的丙酮酸在反應試劑中的LDH的催化下，被NADH還原為乳酸，NADH同時轉變?yōu)镹AD+，由于NADH在340nm處有最大吸收，此時測定340nm下NADH吸光度的下降速率即代表樣品中ALT的活性濃度。本次實驗在1天內完成，重復測定樣品10次，試劑空白測定2次。將測定結果記錄后進行統(tǒng)計學分析。    

　　二、測量不確定度評定的結果與討論

　　1.測定結果中不確定度來源分析
　　樣品中ALT活性濃度C由下式確定:
    
    設:，則式(1)變?yōu)?br />     
    式中:C——樣品中ALT活性濃度，U/L；B_m——樣品反應速率，min^-1；B₀——試劑空白速率，min^-1；ε——NADH在340nm下的摩爾吸光系數(shù)，m²mol^-1；V_R1——反應試劑體積，2.00mL；V_R2——啟動試劑體積，0.20mL；V_s——樣品體積，0.20mL；V_Res——樣品復溶體積，mL；L_m——實驗比色皿實際光徑，mm。
    設，V=V₁+V₂+1，則最終得到測量的數(shù)學模型為
    
    式中:ε為常數(shù)，其不確定度可忽略。因此，V_Res、L_m、V、B這4個輸入量的不確定度是測定結果C的主要不確定度來源。

　　2.評定標準不確定度分量
　　(1)樣品復溶體積(V_Res)的標準不確定度u_VRes
    采用稱重法確定樣品復溶體積，數(shù)學模型為
    
    則有:
    
    因皮重mt與毛重mg是由同一臺天平測量的，所以二者相關，且相關系數(shù)r為-1。由此得到:
    u²_(mg-mt)=u²_mg+u²_mt+2ru_mgu_mt
    u²_mg=u²_mt=u²_天平=u²_偏載+u²_示值+u²_重復
    u²(mg-mt)=(u_mg+u_mt)²=(2u_天平)²
    水溫為23.86℃，因本實驗室溫度計的最大允許誤差為±0.02℃，故測溫誤差對水密度的影響可忽略，水密度ρ的不確定度主要源于密度值本身的擴展不確定度，本文為5×10^-3kg/m³(k=2)。表1列出了復溶體積不確定度評定時的相關數(shù)據(jù)。

表1  復溶體積不確定度評定時標準不確定度分量評定一覽表

　　注:根據(jù)JJG1036-2008《電子天平》檢定規(guī)程中所規(guī)定的天平重復性檢定方法，天平重復性實驗標準差按極差方法計算。本次測得數(shù)據(jù)的極差為0.05mg，測量6次，所以n=6，查表得d_n值為2.53，計算出由重復性引入的標準不確定為1.98×10^-2mg。
    將數(shù)據(jù)代入式(3)，可得出樣品復溶體積:
    V_Res=4.995mL
    將數(shù)據(jù)代入式(4)，則有
    

　　(2)實驗皿光徑修正(L_m)的標準不確定度u_Lm
　　在標準皿與實驗皿中分別加入440nm下吸光度約為0.45的重鉻酸鉀溶液2.00mL，測定440nm處的吸光度，計算得出實驗皿的實際光徑。計算公式為
    
    式中:L_m——實驗皿光徑；A_m、A_s——實驗皿與標準皿吸光度；L_s——標準皿光徑。
    光徑修正不確定度主要源于光度計的透射比準確度與標準皿光徑值的不確定度。當透射比讀數(shù)誤差為1%時，所引起的測定結果相對誤差()約為3%。檢定報告中給出的光度計的透射比誤差為0.2%，所引起的測定結果相對誤差為0.6%。由證書得知，標準皿光徑值的擴展不確定度為U=(1+L_S/100)，k=2。表2中列出了光徑修正不確定度評定的有關數(shù)據(jù)。

表2  光徑修正不確定度評定的相關數(shù)據(jù)

　　將表2中的數(shù)據(jù)代入下式則得到光徑修正的標準不確定度為
    

　　(3)反應速率(B)的標準不確定度u_B
　　在180s內每20s讀取一次吸光度，所得數(shù)據(jù)采用最小二乘法，以時間(min)為自變量、吸光度為因變量得出回歸方程，斜率b的值即為反應速率值，因此，u_B中包含了b的不確定度。溫度T對B的影響也是不能忽略的，通常T每升高10℃，B增加0.5～1.5倍，本例取中間值1.0。由于參考方法要求T的擴展不確定度為0.1℃(k=2)，則相應的反應速率變化為1%。
    B的數(shù)學模型為
    
    式中:A——吸光度；t——監(jiān)測時間；a——回歸方程的截距；b——斜率。
    表3中列出斜率b的標準不確定度評估相關數(shù)據(jù)(以一次測定為例)。

表3  斜率b的標準不確定度評估相關數(shù)據(jù)

　　兩次試劑空白速率的標準不確定度平方分別為(原始數(shù)據(jù)從略):
    u²_B01=u²_b01+u²T₀₁=2.69×10^-8+1.67×10^-10=2.71×10^-8min^-2
    u²_B02=u²_b02+u²_T02=3.94×10^-8+1.35×10^-10=3.95×10^-8min^-2
    代入式(5)，可得出反應速率的標準不確定度為
    

　　(4)加樣體積(V)的標準不確定度u_V
　　由式(2)可知，加樣體積V的數(shù)學模型為
    V=V₁+V₂+1
    因有:
    故V₁與V₂間是相關的，在進行方差合成時需計算兩者的協(xié)方差，公式為
    
    實驗過程中由EPPENDORF加樣槍加注樣品0.20mL(V_s)，由HAMILTON稀釋分配器1號與2號分別加注反應試劑2.00mL(V_R1)與啟動試劑0.20mL(V_R2)。實驗室用稱重法對加樣裝置的準確性與精密度進行驗證，重復次數(shù)n為10，稱量均值為，加樣重復性實驗標準差為SD。則數(shù)學模型為
    
    由于已考慮了加樣重復性，在天平稱量不確定度中可以不考慮天平重復性，因此
    u²_天平=u²_偏載+u²_示值
    表4與表5中列出了加樣體積標準不確定度評估的相關數(shù)據(jù)，部分數(shù)據(jù)可參考表1。

 表4  加樣體積標準不確定度評估相關數(shù)據(jù)    

 表5  重復測定結果及相應的不確定度評估參數(shù)

    由表4中的數(shù)據(jù)可計算得出:
    

　　3.計算合成標準不確定度
　　由式(2)得出ALT活性濃度C的合成標準不確定度為
    
    將前述各值代入式(6)中，得
    

　　4.計算擴展不確定度
　　取包含因子為2，則本例ALT濃度及其擴展不確定度為
　　C=199.6U/L，U_C=3.2U/L(k=2)

　　5.重復測定結果的不確定度評估
　　對于在重復性條件下進行多次測定的結果，其總體均值的不確定度評估應包括單一結果的不確定度及多次測定的重復性。在進行不確定度評估之前應先進行異常值檢驗，將異常值剔除后再進行評估。異常值檢驗可使用Grubbs法或Dixon法。
    總體均值的計算公式為，則有
    
    表5中為重復測定10次的ALT濃度(已進行異常值檢驗)及相應的不確定度評估參數(shù)。
    將數(shù)據(jù)代入式(7)，得出:
    取包含因子為2，則重復性條件下ALT測定均值及其擴展不確定度為
    

　　三、結論

　　在對ALT活性濃度進行不確定度評估時，如測量數(shù)學模型中輸入量間是乘積關系，則標準不確定度分量可以采用相對方差合成的方式計算，不需求出靈敏系數(shù)；當數(shù)學模型不完全是乘積關系時，就不能采用相對標準不確定度合成的方式計算，此時必須計算靈敏系數(shù)，才能將輸入量的不確定度轉化為輸出量的不確定度。本例中在被測量C的函數(shù)關系式中，原來輸入量之間不完全是相乘的關系，經過變換，數(shù)學模型中輸出量轉化為4個輸入量的乘積。這樣就使最終合成標準不確定度的評定簡單方便了。

　　當輸入量間相關時，要考慮相關系數(shù)。在進行本例中的樣品復溶體積(V_Res)的標準不確定度評定時，由于皮重mt與毛重mg是用同一臺天平測量的，因此它們間是相關的，相關系數(shù)r為-1。同樣在評定加樣體積(V)的標準不確定度時，由于V₁與V₂間是相關的，在進行方差合成時計算了兩者的協(xié)方差。
    本文中所描述的評估模式是基于本實驗室ALT測定程序及儀器狀況的，其他實驗室在進行此類評估時，應先根據(jù)具體實驗程序及硬件等情況確定數(shù)學模型與不確定度來源后再進行評定。