正確評價(jià)藥品檢驗(yàn)中的不確定度是藥物分析中的一個難點(diǎn)，有人對HPLC測定咖啡因的不確定度進(jìn)行了研究，但尚未見關(guān)于抗生素微生物檢定法測定中含量不確定度的報(bào)道。本文以阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品的含量標(biāo)定為例，對抗生素微生物檢定法中的不確定度計(jì)算進(jìn)行探討研究，以提高數(shù)據(jù)分析和測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。    

　　一、實(shí)驗(yàn)部分

　　1.儀器與試劑
　　ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)；BP-211D分析天平(瑞士Sartorius公司)；電熱隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，效價(jià)測定用，946μ/mg，批號:130352-200304)與阿奇霉素供試品(中國藥品生物制品檢定所)；Ⅰ號7.8～8.0培養(yǎng)基(批號—040212，北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)、中國藥品生物制品檢定所監(jiān)制)；短小芽孢桿菌〔CMCC(B)63 202〕(中國藥品生物制品檢定所)；磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀等試劑均為分析純；水為去離子純化水。

　　2.標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液的制備
　　(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:精密稱取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.05285g，加乙醇28mL使之溶解，再加滅菌水定量稀釋至50mL，搖勻，得溶液為1000μ/mL。精密吸取該溶液(1000μ/mL)5.0mL，用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋至50mL，搖勻，得溶液為100μ/mL；再分別精密吸取溶液(100μ/mL)5.0mL，分別用磷酸鹽緩沖液(pH7.8)稀釋至50mL與100mL，搖勻，得溶液分別為10μ/mL與5μ/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高、低劑量。

　　(2)供試品溶液的制備:精密稱取阿奇霉素供試品0.05260g(估計(jì)效價(jià)950.6μ/mg)，溶解與稀釋同標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備，得溶液分別為10μ/mL與5μ/mL，作為供試品溶液的高、低劑量。

　　3.雙碟的制備與培養(yǎng)
　　取平底雙碟約10套(n)，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20mL，放置水平臺上使凝固，作為底層。另取加熱融化后的培養(yǎng)基適量，放冷至50℃，加入短小芽孢桿菌的菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5mL，攤布均勻，作為菌層。冷卻后，在每一雙碟中以等距離安置不銹鋼小管4(k)個，待用。將上述稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液分別滴加于不銹鋼小管內(nèi)，在(35～37)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16～18)小時(shí)。

　　4.抑菌圈直徑的測定與效價(jià)計(jì)算
　　取出培養(yǎng)好的雙碟，用抑菌圈測量儀測量各個抑菌圈的直徑，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法(中國藥典2005年版二部附錄XI V中的2.2法)進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)與效價(jià)計(jì)算。當(dāng)可靠性檢驗(yàn)結(jié)果為回歸非常顯著(P<0.01)與偏離平行不顯著(P>0.05)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才成立。    

　　二、結(jié)果與討論

　　1.數(shù)學(xué)模型
　　被測量是供試品的效價(jià)，它取決于標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量、純度與供試品的質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)品溶液產(chǎn)生的直徑、供試品溶液產(chǎn)生的直徑。抑菌圈直徑測定時(shí)，分別對10個雙碟進(jìn)行掃描測定，測定結(jié)果見表1。
    

表1  抑菌圈測量的直徑值(d)

　　效價(jià)由下式給出:
    

　　式中，ms與</i></HTML>mt</i></HTML>分別為標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的質(zhì)量，5mL為移液管的體積，50mL與100mL均為容量瓶的體積。常數(shù)0.3010，由濃度間的比率決定，與所用雙碟數(shù)無關(guān)，因此，劑距為2∶1不變時(shí)，增加雙碟數(shù)，常數(shù)0.3010仍不變。S₂為n個雙碟高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所制的抑菌圈直徑值的總和，S₁為n個雙碟低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所制的抑菌圈直徑值的總和；T₂為n個雙碟高濃度供試品溶液所制的抑菌圈直徑值的總和，T₁為n個雙碟低濃度供試品溶液所制的抑菌圈直徑值的總和。

　　除抑菌圈直徑值引起的輸入量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度外，不確定度還包括標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的稱重、標(biāo)準(zhǔn)品純度、容量瓶體積、移液管體積、抑菌圈測量儀等。這個合成的不確定度即為效價(jià)測定的不確定度。

　　2.各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度
　　(1)抑菌圈直徑值的不確定度分量u(x₁)
　　對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)上述公式計(jì)算效價(jià)(y)為934.2μ/mg，同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析得自由度f=(k-1)(n-1)=27，其合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差即標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
    

　　相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
　　u(x₁)_rel=u(x₁)/y=0.159/934.24=1.70×10^-4

　　(2)抑菌圈測量儀的不確定度分量u(x₂)
    

　　抑菌圈測量儀的最大允許誤差為±0.02mm，則區(qū)間半寬度aP=0.02mm，測量值落在該區(qū)間的概率分布為均勻分布，包含因子，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
　　移菌圈測量儀的標(biāo)準(zhǔn)圈直徑為19mm，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
    

　　(3)配制溶液的不確定度分量u(x₃)
　?、贅?biāo)準(zhǔn)品溶液的不確定度u_s(x₃)
　　a.定容體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_v，A級100.00mL單標(biāo)線容量瓶的容量誤差允許±0.1mL，按三角分布考慮，取，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.04/100=0.0004。

　　用A類方法評定，即通過對容量瓶的重復(fù)實(shí)驗(yàn)可以估算定容變動產(chǎn)生的不確定度。液體的體積與其比重的乘積等于其重量，同一液體的比重為常數(shù)，因此可以對典型的100mL容量瓶定容10次，并稱量求取其標(biāo)準(zhǔn)偏差來評價(jià)其容量配置的重復(fù)性。采用貝塞爾方法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度等于1倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，用A級100.00mL容量瓶配制溶液，稀釋至刻度線的度數(shù)，重復(fù)性引起的不確定度為0.04mL。配置溶液時(shí)，水溫接近20℃，因而溫度的影響可忽略不計(jì)，則定容體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u_v1rel=0.06/100.00=0.0006。
　　同樣地，50.00mL容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度與相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:u_v2=0.05mL與u_v2rel=0.0005。
　　使用100.00mL容量瓶1次與50.00mL容量瓶3次，因此定容體積的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
    

　　b.移取溶液的不確定度分量u_νyrel
　　考慮到移取溶液體積量，認(rèn)為移取溶液的不確定度來自于移液管刻度的不確定度，根據(jù)規(guī)定，5mL移液管的最大允許誤差為±0.015mL，按三角分布考慮，取，則。

　　用A類方法評定，重復(fù)性引起的不確定度為0.008mL。配置溶液時(shí)，水溫接近20℃，因而溫度的影響可忽略不計(jì)，使用移液管2次，則移取溶液的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:。
    c.標(biāo)準(zhǔn)品純度引起的不確定度u_mc
    阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1%，取，則
    d.標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_m
    天平使用說明書給出的天平的分辨力為0.01mg，包含因子，則天平的不確定度
    天平使用說明書給出的天平的重復(fù)性誤差為0.02mg，認(rèn)為服從矩形分布，包含因子，則稱量重復(fù)性不確定度
    標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度
    合成標(biāo)準(zhǔn)品溶液的不確定度u_s(x₃)
    

    ②供試品溶液的不確定度u_T(x₃)
    同樣計(jì)算:
    a.定容體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_vrel
    

    b.移取溶液的不確定度分量u_νyrel
    

    c.供試品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_m
    供試品質(zhì)量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_mrel
    

    合成供試品溶液的不確定度u_T(x₃)
    

    因而配制溶液的不確定度
    

　　3.總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(y)
　　合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度由抑菌圈直徑值觀測列的不確定度即A類不確定度u(x₁)與B類不確定度即移菌圈測量儀的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(x₂)、配置溶液的不確定度u(x₃)組成，它們是各自獨(dú)立的分量，因而可按方和根方式進(jìn)行合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算:    

　　4.擴(kuò)展不確定度
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般用擴(kuò)展不確定度表示。u(y)/y=0.0030，y=934.24μ/mg，u(y)=0.0030×934.24μ/mg=2.80μ/mg。取包含因子k=2(置信概率約為95%)，則擴(kuò)展不確定度為U=2u(y)=2×2.80μ/mg=5.6μ/mg。阿奇霉素效價(jià)測定的結(jié)果可表示為:(934.2±5.6)μ/mg(k=2)。    

　　三、總結(jié)

　　不同參數(shù)對效價(jià)測定不確定度的貢獻(xiàn)不同，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與供試品質(zhì)量對不確定度的貢獻(xiàn)最大；其次為移液管體積不確定度與容量瓶體積不確定度；標(biāo)準(zhǔn)品純度的不確定度、抑菌圈直徑值的不確定度及抑菌圈測量儀不確定度實(shí)際上對總不確定度沒有影響。

　　根據(jù)效價(jià)測定的特點(diǎn)，其操作方法可分為供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的稱量、供試品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備、雙碟的制備與培養(yǎng)、抑菌圈直徑值的測量與效價(jià)計(jì)算等步驟，因此，在計(jì)算時(shí)，應(yīng)先分別計(jì)算各過程的不確定度，再計(jì)算合成相對不確定度，這樣方便理解和計(jì)算。
　　作者單位【河南省藥品檢驗(yàn)所】